P450酶含有血紅素且能催化羥化、環(huán)氧化、脫烷基化、碳-碳偶聯(lián)、氧化裂解等各式各樣不同反應(yīng)，因而被稱為“紅色萬能酶”，通過酶催化可取代日益嚴(yán)重的各種藥物、化學(xué)品生產(chǎn)時(shí)造成的環(huán)境污染問題。但是自P450酶被發(fā)現(xiàn)數(shù)十年來，其晶體結(jié)構(gòu)一直沒能被解析出來，“萬能”酶完整的催化機(jī)理一直困擾著科學(xué)界。近日，湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、省部共建生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的陳純琪教授團(tuán)隊(duì)，和馬立新教授、郭瑞庭教授成功破解難題，在P450酶完整催化機(jī)理的研究方面取得重要突破，該研究成果在最新一期國際權(quán)威期刊《自然·通訊》上發(fā)表。

難識P450酶真面目，解密遭遇瓶頸

“自然界中存在非常多不同種類的P450酶，它們參與細(xì)胞的生理調(diào)控、藥物代謝以及許多重要藥物的合成?！标惣冪鹘榻B，比如我們?nèi)祟惖娜旧w上就帶有超過50個(gè)P450酶的基因，它們負(fù)責(zé)膽固醇、固醇類激素和維生素D等重要化合物的合成；許多具有藥物活性的植物或微生物次級代謝物 (如青蒿素、紫杉醇)，也是由P450酶負(fù)責(zé)催化合成的；還有一些藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，單純以人工合成的方法生產(chǎn)大量高純度的藥物極為困難，只有酶才能夠精準(zhǔn)調(diào)控復(fù)雜的合成途徑。

科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，P450酶能夠識別多種底物，由此利用基因工程改造P450酶來量身訂制化學(xué)反應(yīng)，成為一個(gè)熱門研究方向。2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主阿諾德教授就是利用改造P450酶來進(jìn)行各種困難或者特殊的化學(xué)反應(yīng)。

一個(gè)完整的P450酶系統(tǒng)由三個(gè)部件組成：帶有血紅素的底物結(jié)合區(qū)；負(fù)責(zé)產(chǎn)生電子的還原酶；連接底物結(jié)合區(qū)和還原酶的通道?！斑@就像一個(gè)電器需要插上電才能工作，帶有血紅素的底物結(jié)合區(qū)就像電器本身，供電的插座就像還原酶，而電線就是連接兩端的電子通道?！标惣冪鹘榻B，在建立一個(gè)P450酶反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)需要把所有組件都找齊了，組裝在一起后才能夠進(jìn)行催化反應(yīng)。有一些三種組件都串聯(lián)在一起的P450酶，稱作“自給自足P450酶”，這樣的系統(tǒng)不需要另外尋找相匹配的供電器與電線，因此在應(yīng)用的時(shí)候有巨大優(yōu)勢，也是方便科學(xué)家們研究的“明星P450酶”。

P450酶的血紅素結(jié)合區(qū)識別底物機(jī)制的研究已經(jīng)相當(dāng)成熟，針對底物結(jié)合區(qū)的改造工程也有非常多的研究報(bào)道，但是對于電子如何從還原酶送入活性中心卻仍有許多未知之處。要想知道電子是如何送入活性中心的路徑，最直接的方法就是獲得P450酶的晶體結(jié)構(gòu)，這也等于完全看到酶的長相了。由于全長P450酶在表達(dá)、純化后，酶蛋白很容易斷裂、降解掉，因此難以獲得蛋白質(zhì)晶體，因此從1980年有了第一個(gè)P450酶的底物結(jié)合區(qū)晶體結(jié)構(gòu)后，國內(nèi)及國際上在全長P450酶的結(jié)構(gòu)上，一直沒有任何突破。

“看”清全長結(jié)構(gòu)，解開P450酶催化路徑

陳純琪教授帶領(lǐng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)過不懈的努力，找到了一個(gè)來源于耐熱菌中的自給自足P450酶，這個(gè)P450酶在70度的高溫下也特別穩(wěn)定，也不會(huì)斷裂或是降解，因此特別易于結(jié)晶。陳純琪團(tuán)隊(duì)利用先進(jìn)的X光晶體學(xué)技術(shù)，成功解析了“自給自足P450酶”的高分辨率完整的全長結(jié)構(gòu)。

由于P450酶需要電子實(shí)現(xiàn)催化，就像是一臺(tái)電器，需要插電才能運(yùn)轉(zhuǎn)，但我們卻完全不知道插座、電線在哪。數(shù)十年來，科學(xué)家們只知道P450酶的反應(yīng)需要電子，但不知道電子是怎么送進(jìn)來的。因此陳純琪團(tuán)隊(duì)的研究最終闡明了數(shù)十年間，電子是如何從還原酶區(qū)域送入底物結(jié)合區(qū)來進(jìn)行反應(yīng)的困惑。

“我們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，整個(gè)P450酶的三個(gè)組成部件, 從基因序列的排序依序?yàn)? 血紅素結(jié)合區(qū)—還原酶結(jié)構(gòu)域—鐵氧還蛋白結(jié)構(gòu)域。這三個(gè)區(qū)域各帶有一個(gè)輔因子，分別是血紅素、黃素單核苷酸、[二鐵二硫]，這三個(gè)輔因子也是P450酶內(nèi)部電子傳遞時(shí)所需的中轉(zhuǎn)站。電子傳遞就像送快遞一樣，需要經(jīng)過幾個(gè)中轉(zhuǎn)站?！标惣冪鹘榻B，晶體結(jié)構(gòu)顯示，血紅素結(jié)合區(qū)和還原酶分別位于整個(gè)蛋白質(zhì)的兩端，血紅素結(jié)合區(qū)這一端朝外，露出開口以方便底物進(jìn)入，而電子傳遞經(jīng)過幾個(gè)中轉(zhuǎn)站，最終成功送達(dá)到血紅素進(jìn)行酶催化反應(yīng)。

“黃素單核苷酸到[二鐵二硫]的直線距離較近，為7.9埃(1納米等于10埃)，這樣的距離電子可以直接傳遞過去。但[二鐵二硫]和血紅素的直線距離則長達(dá) 25.3 埃，超過直接電子能傳遞的距離。但是[二鐵二硫]與血紅素之間沒有其他的氧化還原中心存在來協(xié)助傳送電子?！标惣冪鹘忉尩?，科研人員觀察到中間有許多的氨基酸，這些氨基酸可能輔助電子從[二鐵二硫]傳送到血紅素。后續(xù)針對這些氨基酸進(jìn)行突變驗(yàn)證，果真證實(shí)了其中幾個(gè)氨基酸確實(shí)對于P450酶的電子傳遞很重要。

根據(jù)這些結(jié)果, 關(guān)于P450酶的電子如何從黃素單核苷酸通過[二鐵二硫]，傳送到血紅素的合理通路被完整地闡釋。這也是迄今為止國內(nèi)外首次解析“自給自足P450酶”的全長三維結(jié)構(gòu)，是一個(gè)非常重要的里程碑，對于其他各類P450酶的改造與應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。

陳純琪表示，省部共建生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自2018年10月成立以來，重大成果不斷，其研究團(tuán)隊(duì)目前正利用所獲得的結(jié)構(gòu)學(xué)信息，加速對P450酶進(jìn)行更加深入的理性設(shè)計(jì)改造，以期培育出能催化更多重要反應(yīng)的新酶，早日實(shí)現(xiàn)P450酶的綠色生物工藝制造，并應(yīng)用于生物科技、制藥工程與化工產(chǎn)業(yè)。